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ジーン エクスプレッション コーナー |
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-MagNAライザーとTriPureリェージェント- 組織のホモジナイズとトータルRNAの抽出 |
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| 特長 ■簡便─DNA、RNA、タンパク質の分離がこれ1本で可能 はじめに MagNAライザーは、核酸精製の前処理として、自動的に組織や他の生体試料を破砕するための機器です。これは、MagNA Pure LC抽出キットとの組み合わせでの使用に至適化され、ロシュ・ダイアグノスティックスのPCRワークフロー：核酸の抽出用のMagNA Pure LCシステムとLCカローセル遠心器、リアルタイムPCRのライトサイクラーシステムに統合されます。 MagNAライザーによる細胞破砕の基本原理は、ローターの高速往復振動の動きです。細胞の破砕は、サンプルとセラミックビーズの摩擦により起こります。 この実験の目的は組織からトータルRNAを抽出するために、MagNAライザーと組み合わせてのTriPureリェージェントの効率を評価することでした。TriPureアイソレーションリェージェントは、同一サンプルからトータルRNA、DNA、タンパク質を液相ベースにより1ステップで分離できます。この試薬は、ヒト、動物、植物、バクテリア由来の組織で、スケールにかかわらず、良好に作動します。われわれは、両者のアプリケーションを拡げるために、MagNAライザー機器と、フェノールとグアニジンチオシアネートを含むTriPureリェージェントを一緒に使用しました。 材料と方法 動物 8週齢のC57Bl/6マウスをチャールズリバーより購入し、標準的な畜舎で維持しました。 トータルRNAの分離 組織検体は直接に使用、採取後に液体窒素で凍結、あるいはRNA Later溶液（Qiagen, Benelux, Netherlands）中で保存しました。RNA Later溶液は動物組織や他の生体試料中のRNAを保護し、室温での輸送と保存を可能にします。トータルRNAは TriPureリェージェントを使って使用説明書に従い抽出されました。MagNAライザーでの調製過程は以下の通り：肝臓、すい臓、腸、脾臓には6,500 rpmで1ラン50秒;尾では6,500 rpmで3ラン各30秒。 トータルRNAの量と純度 RNA量は260 nmの吸光度で測定、RNAの純度は260 nmと280 nmの比で測定しました。 ハウスキーピングβ-アクチン遺伝子のリアルタイムPCRによるmRNAの定量 最初に、トランスクリプター リバーストランスクリプターゼで逆転写を行いました。ハウスキーピングβ-アクチンをmRNA量の定量に使用しました。ライトサイクラー ファストスタートDNAマスターハイブリダイゼーションキットを以下の条件で使用しました：300 nMのプローブ、300 nMの各プライマー、25 mMのMgCl2。増幅のサイクル条件は以下の通り;95℃で10分間のプレインキュベーション、95℃で0秒と60℃で20秒の45サイクル（温度のランプは20℃/s）。 結果と討論 MagNAライザーとTriPureリェージェントを使用して抽出したトータルRNAとmRNA量を測定するために、260 nmの吸光度の測定と、ライトサイクラー機器を使用したβ-アクチンのリアルタイムRT-PCRを行いました。興味深いことに、MagNAライザーとTriPureリェージェントの使用により、肝臓、すい臓、腸、脾臓、尾から大量のRNAとmRNAが抽出できました（表1、図1）。A260 nm/A280 nmの比率は、高純度のDNA/RNAが同時にこれらの組織から抽出されたことを示しています。 |
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| われわれは使用説明書に述べられたように、TriPureリェージェント量の適応が抽出効率を増大させることを示しました。抽出過程でRNAを安定化させるRNA Laterは、すい臓など大量のRNaseを含む組織に効果的のように思えます。他の組織サンプルでは、TriPureリェージェントのみで安定化には十分でした。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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BIOCHEMICA2004NUMBER4(No97) |
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