細胞DNAフラグメンテーションELISAキット

Cellular DNA Fragmentation ELISA
4-ステップ免疫反応
細胞培養上清,細胞溶解試料中の細胞質におけるBrdU標識DNA断片を検出する光学イムノアッセイキット.[3H]-チミジンを使用したDNA断片化アッセイや[3H]-チミジンリリースアッセイ,[51Cr]-リリースアッセイをノンラジオアクティブ(Non-RI)に置換えた方法.

シグマアルドリッチよりご購入ください
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1キット(500テスト)
保管温度冷蔵 (2-8℃) 毒劇なし

アプリケーション

細胞DNAフラグメンテーションELISAキットは以下の実験系に応用されます.

  • アポトーシス: BrdU標識DNA断片を検出することにより,傷害を受けた細胞の細胞質におけるDNA断片化(フラグメンテーション)を定量します([3H]-チミジン法によるDNAフラグメンテーションアッセイをNon-RIに置き換えた方法).
  • 細胞を介する細胞傷害性: 傷害を受けた標的細胞から培養上清中に放出されるBrdU標識DNA断片を検出します([3H]-チミジンリリースアッセイや[51Cr]-リリースアッセイをNon-RIに置き換えた方法).

利点

  • ノンラジオアクティブNon-RI!
  • 高感度: 1×103細胞/ウェル
  • 低バックグラウンド
  • 希釈操作は含まれません.
  • 細胞を洗浄する必要がありません.
  • キットを用いて得られる結果は標準的な方法と高い相関を示します.
  • マイクロウェーブ照射により,DNAを変性/固定します.
  • スピーディー: 4.5-5.5時間
  • 日本語の使用説明書をダウンロード頂けます.

製品の記述

  • 感度: アポトーシス:細胞質フラクションにおいて1×103細胞/ウェルのBrdU標識DNA断片を検出することが可能です.細胞を介する細胞傷害性:培養上清中において2×103標的細胞/ウェルのBrdU標識DNA断片を検出することが可能です.
  • 特異性: 抗DNA抗体は一本鎖および二本鎖DNAを認識し,BrdU分子とは交叉しません.POD標識抗BrdU,Fab fragments抗体は変性DNAに取込まれているBrdUを特異的に認識します.この抗体は,内在性細胞成分と交叉しません.細胞DNAフラグメンテーションELISAキットはBrdU標識DNAを特異的に検出します.
  • 試料: BrdUを取り込ませた細胞の培養上清あるいは細胞質フラクション(ライセート)(例えば細胞系やその他in vitro増殖細胞など)
  • 測定時間: 4.5-5.5時間

アポトーシス:プログラム細胞死(アポトーシス)は真核生物の細胞死の一般的な形です.アポトーシスを生じている細胞では,細胞膜の急速な消失や核の不明瞭化(消失)といった構造変化が観察されます.核の崩壊には,クロマチンの損傷および内在性のカルシウム依存性エンドヌクレアーゼ活性によるDNAのオリゴヌクレオソームレベルの断片化などが関連しています.細胞を介する細胞傷害性:細胞傷害性T細胞(CTL),ナチュラルキラー(NK)細胞やLAK細胞などの免疫系細胞は,損傷,感染や変異を被った標的細胞を認識し破壊する能力を持ちます.細胞毒(傷害)性には2つのメカニズムが考えられます.a)アポトーシスのメカニズム:エフェクター細胞は,溶解前のゲノムDNAの断片化に特徴づけられる標的細胞の自己溶解カスケードを作動させます.b)溶解のメカニズム:エフェクター細胞から細胞間隙に分泌された溶解分子が重合し,標的細胞膜に溶解孔を形成します.

測定原理

細胞DNAフラグメンテーションELISAキットは,DNAおよびBrdUに対する2種類のマウスモノクローナル抗体を用いた「サンドイッチELISA」の原理に基づいてデザインされた定量アッセイ系です.測定原理は以下の通りです.

  1. 抗DNA抗体をマイクロタイタープレートのウェルに吸着結合させます.
  2. BrdU標識DNA断片を含む試料をウェルに加え,抗DNA抗体を介してDNA断片をウェル壁面に結合させます.
  3. 2で結合したBrdU標識免疫複合体をマイクロウェーブ照射により変性,マイクロプレート上に固定します.3のステップで,検出用抗体が抗原(BrdU)と接近しやすくなります.4.POD標識抗BrdU抗体を反応させ,反応に関与しなかった抗体を除去した後,基質TMBを加えて測定します.

典型的実験


図1. HL60細胞におけるCamptothecin誘導アポトーシス細胞死のカイネティクス
5×104 HL60細胞/mlを200ng/ml camptothecin存在(■,●)下または非存在(□,○)下で1-8時間,37℃でインキュベートした.アポトーシス誘導後,100μl/ウェルの上清(●,○)を細胞DNAフラグメンテーションELISAキットで測定した.更に細胞を溶解(■,□)し,細胞DNAフラグメンテーションELISAキットにて測定した.

キット内容

  1. 抗DNA抗体(clone MCA-33)
  2. POD標識抗BrdU,Fab fragments抗体(clone BMG 6H8)
  3. コーティング用緩衝液
  4. 洗浄用緩衝液
  5. インキュベーション緩衝液
  6. 基質溶液
  7. BrdU標識試薬
  8. カバーフォイル

関連情報

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