細胞傷害性検出キット PLUS (LDH)

Cytotoxicity Detection KitPLUS (LDH)
損傷細胞のサイトゾルから上澄に出た乳酸脱水素酵素(LDH)活性の測定に基づく,細胞死と細胞溶解を定量するための発色アッセイ

シグマアルドリッチよりご購入ください
04744926001
1キット (96ウェルで400テスト)
保管温度冷凍 (-20℃) 毒劇なし
シグマアルドリッチよりご購入ください
04744934001
1キット (96ウェルで2000テスト)
保管温度冷凍 (-20℃) 毒劇なし

アプリケーション

細胞傷害性検出キット(LDH)は,傷害をうけた細胞から放出されるLDH活性を96-Wellマイクロタイタープレートフォーマットによって検出することにより,細胞傷害性/細胞溶解を迅速かつ簡単に定量するシステムです.このキットは細胞膜に傷害をうけた多くの種類のin vitro細胞系に応用することができます.例えば,

  • 細胞を介する細胞傷害性の検出および定量.
  • 介在物質によって誘導される細胞溶解の検討.
  • 環境および医学研究や,食品,化粧品および医薬品製造における,物質の細胞傷害の可能性の検討.
  • バイオリアクターにおける細胞死の検討.

利点

  • ハイスループットに最適:操作ステップがより少なくなっています.移送,遠心,前標識のステップは必要ありません.
  • 柔軟:反応停止液を使用する明瞭なアッセイ条件.
  • 安全-ノンラジオアクティブNon-RI!
  • 高い精度-得られる結果は,溶解した細胞数と強く相関します.
  • 高い感度-細胞数が少ない場合でも,検出が可能です.
  • スピーディー:マルチウェルELISAリーダを使用することにより,大量の試料を処理することが可能です.
  • 簡便性:日本語の使用説明書をダウンロード頂けます.

製品の記述

本キットは,ホモジニアスなフォーマットで行うことが出来,細胞と上澄を分離する移送及び遠心ステップを必要としません.発色反応は明瞭なアッセイ条件のために停止できます.

細胞死は細胞膜の傷害を定量する方法で一般的に評価されてきました.例えばトリパンブルーやヨウ化プロピジウム(PI)を用いた染色を顕微鏡観察によってカウントする方法は幅広く応用されています.これらとは別に,[51Cr]や[3H]-チミジンなどのラジオアイソトープや蛍光色素により,あらかじめ標識された細胞からの放出をアッセイする方法があります.前者では,大量の試料を処理する能力に欠けるという問題があります.また後者では(i)ほとんどの場合,ラジオアイソトープを使用する(ii)目的の細胞をあらかじめ標識する必要がある(iii)標識細胞から自動的に標識分子が放出されてしまうといった問題があります.

第三のアッセイとして,傷害細胞から放出される細胞質由来酵素活性を測定する方法があります.例えばアルカリまたは酸性ホスファターゼなどの放出酵素活性測定がこれまでに記載されています.しかしながらこれらの原理の多くは,細胞における発現量が少ないことや精巧なカイネティクスアッセイを要することなどのマイナス要因によって阻まれてきました.これに対して乳酸脱水素酵素(LDH)は全ての細胞に存在する細胞質由来の安定な酵素で,細胞膜が傷害をうけるとすみやかに培養上清中に放出されます.

試験原理

培養上清を,キットの基質混合液を用いてインキュベートします.トータルの細胞数をカウントするために,基質反応の前に,溶解液を加えます.一連の酵素反応により,テトラゾリウム塩INTがフォルマザンに還元されることによってLDH活性を測定します.死細胞数や細胞膜に傷害をうけた細胞数の増加の結果,培養上清中に放出されるLDH量が増加します.単位時間あたりのフォルマザン生成量は,すなわち上清中に放出された酵素の活性に比例します.このフォルマザン色素は水溶性で,約500 nmの幅広い最大吸収波長を呈します.

サンプル材料

96ウェルや384ウェルマイクロタイタープレートで培養された細胞は直接測定できます.他のフォーマットでの培養細胞は,測定のために細胞を除去することなくマイクロプレートに移送できます.

  • アッセイ時間:インキュベーションに10-30分間.
  • 感度:96ウェルプレート中で100個以下の溶解細胞が検出できます.

典型的な実験


図1. 全細胞培養液中の様々な数のU-937細胞からのLDH活性の測定.
この図は,キットの基質ミックスとの5分間のインキュベーション後の値を示しています.


図2. 全細胞培養液中の様々な数のU-937細胞からのLDH活性の測定.
この図は,基質との30分のインキュベーション後の,細胞数を100個まで落とした場合の値を示しています.


図3. U-937細胞におけるアクチノマイシンDの細胞障害活性の測定.
様々な濃度のアクチノマイシンDが細胞に添加され,その細胞障害性が本キット(LDHPLUS)と細胞増殖試薬WST-1(WST-1)で測定されました.

キット内容

  1. Catalyst (ジアフォラーゼ/NAD+ ミックス)
  2. 色素溶液(INTと乳酸ナトリウム)
  3. 細胞溶解液
  4. 反応停止液

関連情報

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