リバーストランスクリプターゼアッセイ,発色

Reverse Transcriptase Assay, colorimetric
細胞培養上清中の逆転写酵素(reverse transcriptase)の活性を,DNAにジゴキシゲニン標識dUTPを取り込ませることにより定量する,
酵素免疫法のキット

シグマアルドリッチよりご購入ください
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1キット(200テスト)
保管温度冷凍 (-20℃) 毒劇なし

アプリケーション

リバーストランスクリプターゼ活性測定キットは,培養上清やその他の生物学的試料中のRT活性を定量的に検出するためにデザインされています.このアッセイはレトロウイルスに感染された哺乳類細胞におけるウイルスの増殖を研究するために使用されます.また,RT阻害物質のin vitro スクリーニングにも使用されます.

利点

  • 安全 放射性物質(ラジオアイソトープ, RI)を使用する必要がありません.
  • 高感度 ラジオアイソトープを使用した場合と同等の感度が得られます(図参照).
  • 高性能 正確かつ再現性が高い結果が得られます.
  • 簡便 スケールの大きなRTインヒビタースクリーニングが可能です.
  • スピーディー4時間で結果が得られます.
  • 取扱いが簡単 標準的なELISAの実験手順に基づいてデザインされています.
  • フレキシブル HIV-1のみならず多様な生物試料からのRT活性を測定することが可能です.

製品の記述

  • 特異性 このキットでは天然およびリコンビナントのレトロウイルス由来リバーストランスクリプターゼ(RT)の活性を検出します(HIV-1, HIV-2,SIV-1, AMVおよびM-MulV).
  • 感度 20pg HIV-1由来RTを1時間の反応で検出します.また,オーバーナイト反応では1pgを検出可能です.
  • 反応時間 約4時間(1回の酵素反応1時間の場合)または約18時間(1回の酵素反応15時間の場合).
  • 試料 細胞培養上清やその他生物学的試料,RT阻害物質

逆転写酵素(リバーストランスクリプターゼ,RT)の活性測定は, in vitro におけるレトロウイルスの増殖を試験するために幅広く使用されてきました.RTはウイルスのDNA合成初期に必要であり,このことが後天性免疫不全症(AIDS)などの疾患に対する抗レトロウイルス治療において第一のターゲットとされています.RTは通常,さまざまなプライマーを,含むRNAをDNA合成の鋳型として使用します.これまでRT活性の定量には,ヌクレオチドに標識した放射性物質(RI)を測定する方法で行なわれてきました.

測定原理

リバーストランスクリプターゼ活性測定キットは,テンプレートとプライマーにpoly(A)・oligo(dT)15ハイブリッドを使用してRTのDNA合成能力の検討を行ないます.このキットでは[3H]-や[32P]-標識されたヌクレオチドを使用することなく,標準的なRT活性測定を行なうことができます.放射性(RI)標識ヌクレオチドの代わりにジゴキシゲニン(digoxigenin, DIG)-およびビオチン-標識ヌクレオチドがRT活性により同一のDNA分子に至適な比率で取り込まれます.テンプレート/プライマーのハイブリッドをここに添加します.またここで,ウイルス由来のテンプレートなどを使用したい場合など個々の実験目的にあわせてフレキシブルにテンプレートを置換することが可能です.RT活性のパラメーターである合成DNAの検出/定量は,サンドイッチELISAによって行ないます.ビオチン標識DNAがストレプトアビジンコート済みマイクロタイタープレート(モジュール)のウェル面に結合します.次にペルオキシダーゼ標識抗ジゴキシゲニン(anti-DIG-POD)を反応させ,ジゴキシゲニン標識ヌクレオチド(Licensed by InstitutePasteur)と結合させます.最後にPODの基質ABTSを加えます.PODによる基質の分解によって生じる発色強度を吸光度計で測定します.発色強度は試料中のRT活性に比例します.

典型的実験

図1. HIV-1感染HUT78細胞培養上清の希釈系列におけるRT活性の比較.
RT活性測定にはリバーストランスクリプターゼ活性測定キットを使用し,基質増感剤は使用しなかった(□).また放射性(RI)物質[3H]-dTTPを同キットのテンプレート/プライマーハイブリッドpoly(A)・oligo(dT)15に取り込ませたRTアッセイ(●)も行なった.検出限界は,バックグラウンドを加味して検討した結果,双方とも1:1024希釈の培養上清であった.

キット内容

  1. HIV-1リバーストランスクリプターゼ
  2. インキュベーション緩衝液
  3. ヌクレオチド12.
  4. テンプレート/プライマーハイブリッド
  5. Lysis用緩衝液
  6. POD標識抗ジゴキシゲニン(anti-DIG-POD)
  7. 洗浄用緩衝液(10×)
  8. コンジュゲート希釈用緩衝液
  9. 基質用緩衝液
  10. ABTS 基質
  11. 基質増感剤
  12. ストレプトアビジンコート済みマイクロタイタープレート(8ウェルモジュール)
  13. プレートモジュール用フレーム
  14. プレートカバーフォイル

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