リバーストランスクリプターゼアッセイ、化学発光

Reverse Transcriptase Assay, chemiluminescent
化学発光検出によるリバーストランスクリプターゼ活性の高感度定
量的ELISAキット,Non-RI

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1 キット(192回)
保管温度 毒劇なし 販売終了

背景

全てのレトロウイルスファミリーは,リバーストランスクリプターゼ酵素(RT)の存在により特徴づけられます.この酵素はレトロウイルスの特徴的な増幅に関与しており,初期のプロウイルスDNAの合成に必要です.レトロウイルスのライフサイクルに重要なため,RT活性の研究は抗レトロウイルス剤の分析において大きな興味を持たれています.Non-RI化学発光検出によるリバーストランスクリプターゼ活性のELISAキットは,数多くの抗ウイルス物質やRTインヒビターのスクリーニングや,ウイルス量の測定(細胞培養実験)に有用です.

アプリケーション

本キットはRT活性の高感度,定量的検出法として,研究分野で使用するようにデザインされています.このアッセイはレトロウイルス感染哺乳細胞培養中のレトロウイルスの増殖の測定や, in vitroでのRTインヒビターのスクリーニングに使用されます.

原 理

本キットは,テンプレート/プライマーハイブリッドのpoly(A):d(T)15から開始しDNAを合成するリバーストランスクリプターゼの能力を利用しています.

本キットにはこのテンプレート/プライマーハイブリッドが供給されていますが,アッセイの柔軟性により個別に適切なプライマー(ウイルス特異的テンプレート/プライマーハイブリッド)が使用できます.高力価の細胞培養上澄を,ウイルス粒子の精製をせずに直接使用できます.

培養上澄(あるいはウイルスペレット)はウイルス粒子を溶解するために溶解バッファーと組み合わされ,反応バッファーとヌクレオチド存在下でインキュベートされます.ジゴキシゲニンとビオチン標識ヌクレオチド(比は至適化)が,RT存在下新たに合成されたDNA分子に取り込まれます.取り込まれたビオチンにより,DNAはストレプトアビジンコートマイクロタイタープレートに固相化されます.取り込まれたジゴキシゲニンにより,固相化DNAはPOD標識抗ジゴキシゲニンで検出されます.最後にPODの化学発光基質とエンハンサー(ルミノール/4-ヨードフェノール)を加えます.PODによる発光の産生をマイクロプレートケミルミネッセンスリーダーで定量します.このサンドイッチELISA法により,合成DNA量はRT活性のパラメーターとして定量化されます.サンプルの測定は,HIV-1 RTスタンダードの活性での検量線と比較します.

測定系の特徴

  • 特異性 アッセイはHIV-1,HIV-2,SIV-1,CAEV,AMV,M-MuLVなどの天然及び組換えのリバーストランスクリプターゼを検出します.
  • 感度 15時間の反応で>50 fgのRTを検出.
  • 試料 細胞培養上澄や分離ウイルス粒子
  • 測定時間 約4時間

キット内容

  1. HIV-1リバーストランスクリプターゼ,リコンビナント
  2. 溶解バッファー
  3. インキュベーションバッファー
  4. ヌクレオチド(DIG-dUTP, Biotin-dUTP, TTP)
  5. テンプレート
  6. 洗浄バッファー,濃縮
  7. POD標識抗DIG
  8. 標識抗体希釈バッファー
  9. 基質
  10. 開始試薬
  11. ストレプトアビジンコートMTPモジュール(8ウェル,黒),ストリップフレーム付き
  12. 粘着カバーフォイル

実験例

図1. リバーストランスクリプターゼアッセイ,
化学発光とリバーストランスクリプターゼアッセイ,発色(Cat. No. 11468120910)の比較.HUT78細胞は慢性的にHIV-1に感染している.ウイルス粒子を分離,希釈し能書通り15時間アッセイした.

リバーストランスクリプターゼアッセイ,化学発光の利点

  • 安全 RIを使用しない.
  • 高感度 >50 fg(15時間)を検出.
  • 広い測定域 4桁以上の直線性.
  • 直接検出 ウイルス調製の必要が無く,感染培養上澄を測定.
  • 迅速 4時間で結果が得られる.
  • 柔軟性 色々なレトロウイルスのRT活性を検出.
  • 機能試験済み

購入者への注意No.55をご覧ください.